ОФС.1.2.1.1.0003.15 Спектрофотометрія в УФ і видимій областях

1. Вимірювання оптичної щільності
2. прилади
3. ідентифікація
4. кількісне визначення
5. Багатокомпонентний спектрофотометрический аналіз
6. похідна спектрофотометрія
7. прилади
8. Роздільна здатність
9. Методика

Наши партнеры ArtmMisto

Вміст (Table of Contents)

ЗАГАЛЬНА фармакопейних статей

Натомість ОФС ГФ X, ОФС ГФ XI, ОФС 42-0042-07 ГФ XII, ч.1

Зменшення інтенсивності монохроматичного випромінювання, що проходить через гомогенну яка поглинає середу, кількісно описується законом Бугера-Ламберта-Бера:

log 10 (1 / Т) = А = ε ∙ c ∙ b, (1)

де:

• Т - пропускання, відношення інтенсивності світлового потоку, що пройшов через речовину, до інтенсивності падаючого на речовину світлового потоку; Т = I / I 0;
• I - інтенсивність минулого монохроматичноговипромінювання;
• I 0 - інтенсивність падаючого монохроматичного випромінювання;
• ε - молярний показник поглинання;
• с - молярна концентрація речовини в розчині;
• b - довжина оптичного шляху або товщина шару, в сантиметрах.

Величина log 10 (1 / Т) носить назву оптичної щільності, позначається буквою А і є вимірюваноївеличиною. У відсутності інших фізико-хімічних чинників виміряна оптична щільність (А) пропорційна концентрації речовини в розчині (с) і товщині шару (b).

величина є питомий показник поглинання, тобто оптичну щільність розчину речовини з концентрацією 10 г / л (1 г / 100 мл) в кюветі з товщиною шару 1 см. Величини і ε пов'язані співвідношенням:

де:

М.м. - молекулярна маса досліджуваної речовини.

Вимірювання оптичної щільності

Якщо немає інших вказівок у фармакопейної статті, вимір оптичної щільності проводять при зазначеній довжині хвилі з використанням кювет з товщиною шару 1 см і при температурі (20 ± 1) ° С в порівнянні з тим же розчинником або тієї ж сумішшю розчинників, в якій розчинено речовина . При вимірюванні оптичної щільності розчину при даній довжині хвилі оптична щільність кювети з розчинником, виміряна проти повітря при тій же довжині хвилі, не повинна перевищувати 0,9 і, бажано, щоб вона була не менше 0,2.

Спектр поглинання представляють таким чином, щоб оптична щільність або її деяка функція були приведені по осі ординат, а довжина хвилі або деяка функція довжини хвилі - по осі абсцис.

Якщо в фармакопейної статті для максимуму поглинання вказується тільки одна довжина хвилі, то це означає, що отримане значення максимуму не повинно відрізнятися від зазначеного більш ніж на ± 2 нм.

прилади

Спектрофотометри, призначені для вимірювань в ультрафіолетовій і видимій областях спектра, складаються з оптичної системи, що виділяє монохроматичне випромінювання в області від 190 до 800 нм і забезпечує його проходження через зразок, і пристрої для вимірювання оптичної щільності.

Основними частинами цих приладів є: джерело випромінювання, диспергирующий прилад (призма або решітка), щілину для виділення смуги довжин хвиль, кювети для зразків, детектор випромінюваної енергії, вбудовані підсилювачі і вимірювальні прилади.

Перевірка шкали довжин хвиль в ультрафіолетовій і видимій області. Точність калібрування приладу за шкалою довжин хвиль в спектральному ряду перевіряють за наведеними в табл. 1 спектральним лініях водневої (Hβ) або дейтерієвої (Dβ) розрядної лампи, лініях парів ртуті (Hg) кварцево-ртутної дугової лампи, а також за максимумами поглинання розчину гольмію перхлората (Ho) (готовий реактив для калібрування спектрофотометра є 4% розчин гольмію оксиду в 14,1% розчині хлорного кислоти). Допустиме відхилення становить ± 1 нм для ультрафіолетової і ± 3 нм для видимої області.

Таблиця 1 - Максимуми поглинання для перевірки шкали довжин хвиль

241,15 нм (Але) 404,66 нм (Hg) 253,7 нм (Hg) 435,83 нм (Hg) 287,15 нм (Але) 486,0 нм (Dβ) 302,25 нм (Hg) 486 , 1 нм (Нβ) 313,16 нм (Hg) 536,3 нм (Але) 334,15 нм (Hg) 546,07 нм (Hg) 361,5 нм (Але) 576,96 нм (Hg) З65, 48 нм (Hg) 579,07 нм (Hg)

Шкала довжин хвиль може бути калібрувати також за допомогою відповідних скляних фільтрів, які мають фіксовані смуги поглинання у видимій і ультрафіолетовій областях, а також стандартних стекол, що містять дидим (суміш празеодіма і неодиму), і стекол, що містять Гольмій.

Перевірка шкали оптичної щільності. Для перевірки шкали оптичної щільності використовують стандартні неорганічні скляні фільтри або розчин калію дихромата при довжинах хвиль, зазначених у табл. 2, де для кожної довжини хвилі наведено точне значення питомого показника поглинання і допустимі межі.

Розчин калію дихромата для перевірки шкали оптичної щільності при 235, 257, 313 і 350 нм готують наступним чином: від 57,0 до 63,0 мг (точна наважка) калію дихромата, попередньо висушеного до постійної маси при температурі 130 ° С, розчиняють в 0,005 М розчині сірчаної кислоти і доводять об'єм розчину тим же розчинником до 1000 мл. Для перевірки оптичної щільності при 430 нм, розчиняють 57,0-63,0 мг (точна наважка) калію дихромата в 0,005 М розчині сірчаної кислоти і доводять об'єм розчину тим же розчинником до мітки.

Таблиця 2 - Питома показник поглинання стандартів при різних довжинах хвиль

Довжина хвилі, в нанометрахПитома показникпоглинанняМежі для

235 124,5 Від 122,9 до 126,2 257 144,5 Від 142,8 до 146,2 313 48,6 Від 47,0 до 50,3 350 107,3 ​​Від 105,6 до 109,0 430 15 , 9 Від 15,7 до 16,1

Граничний рівень розсіяного світла. Розсіяне світло може бути виявлений при даній довжині хвилі з використанням відповідних фільтрів або розчинів: наприклад, оптична щільність розчину 12 г / л калію хлориду в кюветі з товщиною шару 1 см різко збільшується між 220 і 200 нм і повинна бути більше 2 при 198 нм при використанні води в якості розчину порівняння.

Роздільна здатність (для якісного аналізу). Якщо є вказівка ​​в фармакопейної статті, визначають роздільну здатність спектрофотометра наступним чином. Записують спектр 0,02% (об / об) розчину толуолу в гексані. Мінімально допустиме значення відносини оптичної щільності в максимумі поглинання при 269 нм до оптичної щільності в мінімумі поглинання при 266 нм вказують в фармакопейної статті.

Ширина спектральної щілини (для кількісного аналізу). У разі використання спектрофотометра із змінною шириною спектральної щілини при обраної довжині хвилі можливі похибки, пов'язані з шириною цієї щілини. Для їх виключення ширина щілини повинна бути малою порівняно з напівшириною смуги поглинання (шириною на половині оптичної щільності) і в той же час повинна бути максимально велика для отримання високого значення інтенсивності падаючого монохроматичного випромінювання (I0). Таким чином, ширина щілини повинна бути такою, щоб подальше її зменшення не змінювало величину вимірюваної оптичної щільності.

Кювети. Допустимі відхилення в товщині шару використовуваних кювет повинні бути не більше ± 0,005 см. Кювети, призначені для випробуваного розчину і розчину порівняння, повинні мати однакове пропускання (або оптичну щільність) при заповненні одним і тим же розчинником. В іншому випадку ця різниця слід враховувати.

Вимоги до розчинників. Для визначень, вироблених в ультрафіолетовій і видимій областях, зразок аналізованого речовини розчиняють у відповідному розчиннику, який повинен бути оптично прозорим в використовуваної області довжин хвиль. Для цих областей довжин хвиль придатні багато розчинники, в тому числі вода, спирти, хлороформ, нижчі вуглеводні, ефіри і розбавлені розчини сильних кислот і лугів.

ідентифікація

Абсорбційну спектрофотометрію в ультрафіолетовій і видимій областях спектра застосовують для визначення автентичності лікарських засобів шляхом:

- порівняння спектрів поглинання випробуваного розчину і розчину стандартного зразка; в зазначеній галузі спектра має спостерігатися збіг положень максимумів, мінімумів, плечей і точок перегину;

- вказівки положень максимумів, мінімумів, плечей і точок перегину спектра поглинання випробуваного розчину; розбіжність між спостережуваними і зазначеними довжинами хвиль в максимумах і мінімумах поглинання не повинно зазвичай перевищувати ± 2 нм.

Можливі й інші варіанти застосування, обумовлені в фармакопейних статтях.

кількісне визначення

Визначення концентрації речовин спектрофотометричним методом засновано на використанні закону Бугера-Ламберта-Бера:

де:

С - концентрація речовини в г / 100 мл;

А - оптична щільність досліджуваного розчину;

- питомий показник поглинання речовини;

b - довжина оптичного шляху або товщина шару, в сантиметрах.

У ряді випадків, навіть при використанні монохроматичноговипромінювання можуть спостерігатися відхилення від закону Бугера-Ламберта-Бера, обумовлені процесами дисоціації, асоціації та комплексоутворення. Тому попередньо слід перевірити лінійність залежності оптичної щільності розчину від концентрації в аналітичній області. При наявності відхилень від лінійної залежності слід користуватися не формулою (3), а експериментально знайденої залежністю.

Зазвичай визначення концентрації спектрофотометричним методом проводять з використанням стандартного зразка. Розрахунок концентрації заснований на використанні рівняння:

де:

З і С 0 - концентрації випробуваного розчину і розчину стандартного зразка, відповідно;

А та А 0 - оптичні щільності випробуваного розчину і розчину стандартного зразка, відповідно.

Концентрації випробуваного і стандартного розчину повинні бути близькі.

Спочатку вимірюють оптичну щільність розчину стандартного зразка, приготованого, як зазначено в фармакопейної статті, потім проводять вимірювання оптичної щільності випробуваного розчину. Другий вимір проводять відразу після першого, з використанням тієї ж кювети, в тих же експериментальних умовах.

Метод з використанням стандартного зразка є більш точним і надійним. Можливість застосування значення питомого показника поглинання в кожному конкретному випадку слід обґрунтовувати. Зазвичай метод з використанням значення питомого показника поглинання застосуємо при допусках змісту аналізованого речовини не менше ± 10% від номінального змісту.

Багатокомпонентний спектрофотометрический аналіз

Багатокомпонентний спектрофотометрический аналіз (аналіз сумішей) застосовують для одночасного кількісного визначення кількох компонентів лікарських засобів, кожне з яких підкоряється закону Бугера-Ламберта-Бера.

Кількісне визначення в багатокомпонентному спектрофотометричному аналізі грунтується зазвичай на використанні рівняння:

де:

А i - оптична щільність досліджуваного розчину при i -ої довжині хвилі;

Е ij - показники поглинання (залежні від способу вираження концентрації) j -го компонента зразка при i -ої аналітичної довжині хвилі;

c j - концентрація j -го компонента зразка.

Відповідні методики проведення аналізу та розрахункові формули вказуються в фармакопейних статтях.

похідна спектрофотометрія

У похідною спектрофотометрії вихідні спектри поглинання (нульового порядку) перетворюються в спектри похідних першого, другого і більш високого порядків.

Спектр першої похідної є графік залежності градієнта кривої поглинання (швидкість зміни оптичної щільності від довжини хвилі, dA / dλ) від довжини хвилі.

Спектр другої похідної є графік залежності кривизни спектра поглинання (d 2 A / dλ 2) від довжини хвилі. Друга похідна при будь-якій довжині хвилі пов'язана з концентрацією наступним співвідношенням:

де:

А - оптична щільність при довжині хвилі λ;

- питомий показник поглинання при довжині хвилі λ;

с - концентрація речовини в розчині, в грамах / 100 мл;

l - товщина шару, в сантиметрах.

Похідна спектрофотометрія може бути використана як для цілей ідентифікації речовин, так і для їх кількісного визначення в багатокомпонентних сумішах, а також в тих випадках, коли є фонове поглинання, викликане присутністю речовин, вміст яких не регламентується.

прилади

Використовують спектрофотометри, що відповідають зазначеним вище вимогам і оснащені аналоговим резистивної-ємнісний дифференцирующим модулем або цифровим диференціатором, або іншими засобами отримання похідних спектрів, відповідно до інструкції до приладу. Деякі методи отримання спектрів другої похідної приводять до зміщення довжин хвиль щодо вихідного спектра, що слід враховувати там, де це необхідно.

Роздільна здатність

Якщо вказано в фармакопейних статтях, записують спектр другої похідної для розчину 0,2 г / л толуолу в метанолі, використовуючи метанол в якості розчину порівняння. На спектрі повинен бути присутнім невеликий негативний екстремум, розташований між двома великими негативними екстремумами при 261 нм і 268 нм, відповідно до рис. 1. Якщо немає інших вказівок у фармакопейних статтях, ставлення А / B має бути не менше 0,2.

Методика

Процедура аналізу аналогічна застосовуваної в звичайній спектрофотометрії, але замість оптичної щільності використовують похідні. Готують розчин випробуваного зразка, налаштовують прилад відповідно до інструкції виробника і розраховують кількість визначається речовини, як зазначено в фармакопейної статті.

Малюнок 1 - Спектр другої похідної розчину толуолу (0,2 г / л) в метанолі

Завантажити в PDF ОФС.1.2.1.1.0003.15 Спектрофотометрія в УФ і видимій областях